Western blotting je tehnika koja se koristi za detekciju specifičnih proteina u uzorcima. Ova metoda je od suštinskog značaja u biokemiji i molekularnoj biologiji, a koristi se u raznim istraživačkim i kliničkim primjenama, uključujući analizu ekspresije gena, identifikaciju proteina i proučavanje interakcija između proteina. U ovom članku, objasnit ćemo kako Western blotting funkcionira, korak po korak.
Prvi korak u Western blotting postupku je priprema uzorka. Uzorci proteina mogu biti izolirani iz različitih izvora, uključujući stanične kulture, tkiva ili biološke tekućine. Nakon izolacije, proteini se obično denaturiraju pomoću redukcijskih agenasa kao što je β-merkaptopropanol ili ditiotreitol, što omogućuje da se proteini razdvoje prema veličini. Ovaj korak je ključan za osiguravanje da se proteini pravilno razdvajaju tijekom sljedeće faze postupka.
Nakon denaturacije, proteini se razdvajaju pomoću gel elektroforeze. Ovaj proces uključuje korištenje poliakrilamidnog gela, koji omogućuje separaciju proteina prema njihovoj veličini. Manji proteini prolaze kroz gel brže od većih, što rezultira razdvajanjem proteina u različite trake. Nakon elektroforeze, gel se obično prenosi na membranu, najčešće nitroceluloznu ili PVDF (polivinilidenfluorid) membranu. Ovaj proces se naziva transfer i obično se provodi pomoću elektrotransfera, gdje se primjenjuje električno polje kako bi se proteini prenijeli iz gela na membranu.
Nakon transfera, membrana se tretira kako bi se blokirali nespecifični binding siteovi. Ovaj korak je važan kako bi se spriječilo da antitijela vežu nespecifične dijelove membrane, što bi moglo dovesti do lažnih pozitivnih rezultata. Obično se koristi BSA (bovin serum albumin) ili mliječni protein kao blokator. Nakon blokiranja, membrana se može inkubirati s primarnim antitijelom, koje specifično prepoznaje ciljani protein. Ovaj korak traje određeno vrijeme i može se provoditi na sobnoj temperaturi ili na 4°C tijekom noći, ovisno o protokolu.
Nakon inkubacije s primarnim antitijelom, membrana se ispire kako bi se uklonili nespecifični kompleksi, a zatim se inkubira s sekundarnim antitijelom koje je označeno enzimom ili fluoroforom. Sekundarno antitijelo je specifično za primarno antitijelo i omogućuje detekciju ciljano vezanog proteina. U slučaju da se koristi enzim, poput HRP (horseradish peroxidase), membrana se može tretirati supstratom koji će reagirati s enzimom, stvarajući signal koji se može detektirati.
Posljednji korak u Western blotting postupku je detekcija. Ovisno o tome koji je sustav korišten za označavanje sekundarnog antitijela, signal se može detektirati pomoću različitih metoda. Ako se koristi kemiluminiscencija, membrana se izlaže rendgenskoj foliji koja bilježi emitirane svjetlosne signale. Alternativno, ako se koristi fluorescentno označeno antitijelo, membrana se može analizirati pod fluorescentnim mikroskopom ili pomoću specijaliziranih detektora. Rezultat je slika s jasnim trakama koje prikazuju prisutnost i relativnu količinu ciljane proteine.
Western blotting je izuzetno korisna tehnika koja omogućava istraživačima da proučavaju proteine na vrlo detaljnoj razini. Iako proces može biti vremenski zahtjevan i zahtijeva preciznost, rezultati su vrlo informativni i često se koriste u znanstvenim istraživanjima, dijagnostici bolesti i razvoju novih terapija. Razumijevanje kako Western blotting funkcionira može pomoći u pravilnom izvođenju eksperimenta i interpretaciji rezultata, čime se dodatno doprinosi znanstvenom napretku.
